Фидеслаб - Аллергодиагностика

Диагностика аллергии

 Аллергия    Анализы на аллергию  Анализ на аллергены  Прайс-лист   О лаборатории  На главную
------------------- -------------------
Диагностика аллергии >>> О лаборатории, контакты >>> Основные методики >>> Инструкция на метод РВМ

Метод диагностики аллергии в реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами
(инструкция на метод)

Авторы:

Ассистент кафедры аллергологии и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков.
Под ред. академика РАЕН, д.м.н., профессора Д.К. Новикова



Показания к применению

Все виды аллергопатологии. Анафилактический шок, атопический дерматит, бронхиальная астма, аллергический ринит. Аллергологический скрининг населения, проживающего в экопатологических регионах.

Перечень необходимого оборудования

  1. Центрифуга (500-1000 об/мин)
  2. Стерильные одноразовые шприцы до 20 мл (2-3 шт.)
  3. Стерильные пробирки 10 –20мл (20-30 шт.)
  4. Термостат
  5. Холодильник
  6. Автоматические дозаторы 20 – 200 мкл
  7. Планшеты для иммунологических реакций: плоскодонные и круглодонные (10-100).
  8. Анализатор планшеточного типа АИФ-01С, любой другой фотометр с длиной волны 450 нм (необязательно).

Реактивы

  1. Физиологический раствор хлорида натрия на фосфатном буфере (ФРФ) рН 7,2 или раствор Хенкса.
  2. Лизирующий раствор: 0,84% раствор хлористого аммония (в случаях малого количества крови для полного лизиса эритроцитов).
  3. Глюкоза.
  4. Хлористый кальций.
  5. Фосфат-цитратный буферный раствор с рН 5,0.
  6. Перикись водорода – 0,015% раствор.
  7. Хромоген: тетраметилбензидин (ТМБ) или ортофенилендиамин (ОФД).
  8. Набор аллергенов (панели: бытовые, пищевые, грибковые, бактериальные, пыльцевые, лекарственные).

Описание технологии применения метода

Техника реакции

А. Подготовка клеток больного для постановки реакции выброса миелопероксидазы:

  1. Получение лейкосуспензии. Кровь берут из вены в пробирку с гепарином (20 ед. на 1 мл крови). В зависимости от количества проб с аллергеном достаточно от 3 до 10 мл крови. Кровь отстаивают в узких пробирках до момента четкого отделения эритроцитов от плазмы (не перестаивать – осядут лейкоциты). Плазму с лейкоцитами отсасывают, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин. Плазму отсосасывают. К осадку лейкоцитов добавляют лизирующий эритроциты раствор (0,84% теплый (37оС) раствор хлористого аммония) до 8-10 мл. Ресуспензируют и снова центрифугируют. Затем, полученную лейкосуспензию отмывают не менее трех раз стерильным физиологическим раствором на ФРФ, содержащим 0,2% глюкозу и 0,0025% CaCl2.

  2. Разведение суспензии. Разведение клеток в лейкосуспензии должно быть: при содержании 6-9. х 109 кл/л - 1/3 от объема крови, например, из 10 мл крови выделяют суспензию и доводят объем до 3,3 мл стерильным физиологическим раствором на ФРФ, содержащим 0,2% глюкозу и 0,0025% CaCl2.. При более низком содержании лейкоцитов разведение лейкосуспензии должно состовлять 1/4-1/5 от объема крови, при высоком содержании – более 12 х 109 – 1/2,5- 1/2 от объема крови.

Б. Подготовка аллергенов. В реакции используют специальные наборы аллергенов после нейтрализации их пероксидазной активности. Все аллергены перед постановкой теста разводят стерильным ФРФ до концентрации 100 PNU/мл.

При постановке реакции с лекарствами препараты коньюгатов лекарств с ЧСА разводят стерильным ФРФ до 1:1000 средней терапевтической дозы на кг массы тела.

Ход реакции

  • В круглодонные лунки иммунологических планшет или микропробирки вносят 0,100 мл (100 мкл) аллергена и добавляют равный объем лейкосуспензии. Пробы дублируют. Параллельно ставятся холостые пробы лейкосуспензии каждого больного со стерильным физиологическим раствором (отрицательный контроль).
  • Смесь инкубируют 45 мин при 37оС.
  • Центрифугируют (если планшеты то на планшеточной центрифуге) в течении 10 мин при 1500 об/мин.
  • Перенос надосадочной жидкости из микропробирок и/или круглодонной планшеты. Из каждой лунки круглодонной планшеты и/или микропробирки осторожно (чтобы не отсосать клетки) забирается 50 мкл надосадочной жидкости и переносится в лунку (под тем же номером) плоскодонной планшеты для ИФА и/или другую микропробирку.
  • Внесение проявляющего раствора. Во все лунки планшеты для ИФА и/или микробробирки к надосадочной жидкости добавляется по 150 мкл хромоген-субстратной смеси (0,015% Н2О2 и ТМБ или ОФД, разведенными фосфат-цитратным буфером с рН 5,0) Проявляющий раствор готовиться непосредственно перед внесением.
  • Инкубация при комнатной температуре в течении 15-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета (при использовании ТМБ).
  • Остановка реакции внесением 50 мкл 4% серной кислоты, цвет раствора изменяется на желтый.

Учет результатов
Оценку реакции проводят визуально, либо на фотометре при длине волны 450 нм.

Примечание: отрицательный контроль – не должен быть окрашен, либо слабо окрашен. (При замере на фотометре оптическая плотность в отрицательной лунке не должна превышать 0,300 е.д. оптической плотности).

Положительной реакция считается:

А. При визуальной оценке результатов – окраска опытной пробы более желтая, чем пробы отрицательного контроля и легко различима. По окрашенной шкале - оценка от «+» до «+++». В других случаях реакция трактуется как сомнительная.

Б. При фотометрической оценке результатов: оптическая плотность опытной пробы превышает оптическую плотность пробы отрицательного контроля не менее чем вдвое и она не меньше 0,600. При превышении оптической плотности опытной пробы по сравнению с пробой отрицательного контроля менее чем в 2 раза, а также в других случаях результат считается сомнительным.

Возможные ошибки проведения реакции:

А. Интенсивное окрашивание в лунке отрицательного контроля:

  1. Взбалтывание при переносе надосадочной жидкости.
  2. Несвоевременная остановка реакции.
  3. Очень густая лейкосуспензия (в этом случае все лунки опытных проб будут окрашены, но неодинаково).
  4. Возможна нестабильность клеточных мембран лейкоцитов больного и их повреждение (в этом случае все лунки опытных проб будут одинаково окрашены).
Б. Другие:
  1. Неправильно приготовлен или неактивен проявляющий раствор.
  2. Сильно разведена лейкосуспензия.

Противопоказания к применению

Метод применяется в условиях in vitro, абсолютных противопоказаний нет, относительным является ранний возраст пациента до 1 года, когда трудно получить достаточное количество крови для исследования.


МЕДИКО-СОЦИАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА
диагностики аллергии в реак­ции выброса миелопероксидазы гранулоци­тами.

Известно, что в острый период аллергических заболеваний, та­ких как бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит и др. в очаге воспаления наряду с эозинофилами, тучными клетками и Т-лимфоцитами присутствуют нейтрофилы [1,2,3]. После контакта с аллергеном эти клетки активируются и секретируют спе­цифические для них белки: эозинофильный катионный белок, эози­нофильную пероксидазу, миелопероксидазу и триптазу. Данные белки определяются в разных биологических жидкостях (сыворотка крови, мокрота, лаважная жидкость). Миелопероксидаза является специфическим и доступным для клинического исследования мар­кером гранулоцитов [4]. Наибольшее ее содержание обнаружено в азу­рофильных секреторных гранулах нейтрофилов. По данным литературы, встраивание секреторных гранул в плазматическую мембрану гранулоцитов с последующей секрецией миелопероксидазы может запускаться хемоаттрактантами (например, N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином (fMLP)) или же при взаимодействии Ig-ов, связанных Fc-рецепторами с соответствующими аллергенами, причем активность фермента миелопероксидазы повышается до секреции ее из гранул [5,6]. На поверхности всех лейкоцитов имеются Fc-рецепторы, которые связывают Fc-фрагменты иммуноглобулинов различных классов (IgG, IgE, IgA), в том числе обладающие специфичностью антитела. Поэтому, с одной стороны, лейкоциты с помощью этих антител могут специфично взаимодействовать с антигенами-аллергенами, с другой – концентрация антител в крови снижается и нередко из-за этого они не выявляются в сыворотке крови. Базофилы имеют Fce- рецепторы, связывающие IgE, а нейтрофилы несут Fce, фиксирующие IgG, три типа рецепторов Fce, различающиеся по аффиности, связывающие IgE [1,7,8]. В настоящее время для выявления антител, связанных с лейкоцитами используются показатель повреждения нейтрофилов (тест ППН) и реакция повреждения гранулоцитов (РПГ)[1,7]. Основной недостаток этих методов – необходимость трудоемкого процесса окрашивания мазков и визуального подсчета поврежденных клеток, используя иммерсионную систему микроскопа, что практически исключает их применение для скрининговых исследований.

Для диагностики различных видов аллергии нами предлагается реакция выброса миелопероксидазы (РВМ) под влиянием аллергена. Сущность ее заключается в том, что определяется прирост активности миелопероксидазы после инкубации гранулоцитов с аллергенами в надосадочной жидкости с помощью субстрат-хромогенной смеси (ортофенилендиамина или тетраметилбензидина и перикиси водорода) по интенсивности окраски субстрат-хромогенной смеси, что позволяет диагностировать наличие или отсутствие сенсибилизации гранулоцитов и аллергии in vitro визуально или оценить степень сенсибилизации гранулоцитов человека к аллергену на фотометре.

Литература

  1. Д.К. Новиков, Ю.В. Сергеев, П.Д. Новиков. Лекарственная аллергия. – М.: Национальная академия микологии,2001. –330с.
  2. Vence P. Inflammation markers in asthma.- Kolloq. «Asthma bronchiale: Neue Erkenntnisse Klin. und Prax., Bad Reichenhalle, 21.-22. Juni, 1997» // Atemwegs-und Lungenkrankh. – 1997.-№10 - Р.580-582.
  3. Schneider T., Issekutz A.C. Quantitation of eosinophil and neutrophil infiltration into rat lung by specific assays for eosinophil peroxiase and myeloperoxidase: Application in a Brown Norway rat model of allergic pulmonary inflammation. // J. Immunol. Meth. –1996.-№1.-Р.1-14.
  4. Leavey P.J., Sellins K.S. Thurman G., Elzi D., Hiester A., Silliman C.C., Zerbe G., Cohen J.J., Ambruso D.R. In vivo treatment with granulocyte colony-stimulating factor results in divergent effects on neutrophil functions measured in vitro // Blood.-1998.-№11.- Р. 4366-4374.
  5. Tapper H., Grinstein S. Fc Receptor-triggered insertion of secretory granules into the plasma membrane of human neutrophils: Selective retrieval during phagocytosis // J. Immunol. – 1997.-№1.- Р. 409-418.
  6. Zipfel M., Carmine T.C.; Gerber C. Niethammer D., Bruchelt G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-meth-leu-phe prior to its release from neutrophil granulocytes//Biochem. and Biophys. Res. Commun. – 1997.- №1- Р. 209-212..
  7. Д.К. Новиков, В.И. Новикова. Оценка иммунного статуса. М.,-1996.-281с.
  8. Monteseirin J, Bonilla I, Camacho MJ, Conde J, Sobrino F. IgE-dependeht release of myeloperoxidase by neutrophils from allergic patients // Clin. Exp. Allergy –2001- Vol. 31-P. 889-892
  9. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Е.Б. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая школа,1991. - 285 с
  10. Д.К. Новиков, В.И. Новикова, П.Д. Новиков. Пищевая аллергия.- Витебск: ВГМУ.-1998.-76с.
  11. Ramos C.L., Pou S., Rosen G.M. Effect of anti-inflammatory drugs on myeloperoxidase-dependent hydroxyl radical generation by human neutrophils// Biochem. Pharmacol. – 1995.- №8.- Р. 1079-1084
  12. Новиков П.Д., Новикова Н.Д. Диагностика аллергии в реакции выброса миелопероксидазы под влиянием аллергена // Иммунопатология, аллергология, инфектология –2002.-№1.-С.64-69

Ассистент кафедры аллергологии и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков

Ассистент кафедры детских болезней Н.Д. Новикова

Академик РАЕН, д.м.н, профессор Д.К. Новиков

ОТЧЕТ О ПРЕДВАРИТЕЛЬНОМ КЛИНИЧЕСКОМ ИСПЫТАНИИ
метода диагностики аллергии в реак­ции выброса миелопероксидазы гранулоци­тами.

Нами было обследовано всего 218 больных, которые были разделены на четыре группы по данным анамнеза и специфического аллергологического обследования in vivo и 25 доноров не болевших аллергическими заболеваниями, которые составили контрольную группу.

1-ю группу составили 54 больных с сенсибилизацией к бытовым аллергенам домашней пыли и перу подушки. Во 2-ю группу вошли 64 больных с сенсибилизацией к пыльцевым аллергенам. В 3-ю группу включили 67 больных с пищевой аллергией. К 4-й группе отнесли 33-х больных с сенсибилизацией к пенициллину.

Для оценки достоверности РВМ нами было проведено исследование выброса миелопероксидазы лейкоцитами больных 1-4-й групп и контрольной группы на причинный и контрольный аллерген (см. табл.1).

Причинным аллергеном служил аллерген к которому у пациента была выявлена сенсибилизация по данным специфического аллергологического обследования in vivo. В качестве контрольного аллергена использовался аллерген к которому у пациента сенсибилизация не выявлялась по результатам специфического аллергологического обследования in vivo. Спонтанный выброс оценивался по реакции с физиологическим раствором. Уровень выброса миелопероксидазы оценивали по величине оптической плотности в реакции надосадочной жидкости с хромоген-субстратной смесью.

Из результатов приведенных в табл.1, видно, что нет достоверной статистической разницы между выбросом миелопероксидазы у больных аллергическими заболеваниями на контрольный аллерген и контрольной группой доноров, а также спонтанным выбросом. В то же время, достоверно (р< 0,001) высокий уровень активности миелопероксидазы при инкубации с аллергеном, к которому выявлена сенсибилизация в 1-4-ой группах и с fMLP в контрольной группе говорят о достоверном и специфичном выбросе миелопероксидазы.

Таблица 1

Уровень активности миелопероксидазы (M+m) в надосадочной жидкости после инкубации лейкоцитов больных 1-4-й групп с достоверно выявленной сенсибилизацией и контрольной группы с причинными и контрольными аллергенами

Группы
больных
Аллергены Активность миелопероксидазы, е.д ОП
Причинный
аллерген
Контрольный
аллерген
Спонтанный
выброс
1-я (n=54) Бытовые 0,804+-0,126 * 0,241+-0,092 0,220+-0,074
2-я (n=64) Пыльцевые 0,793+-0,142 * 0,226+-0,075 0,176+-0,098
3-я (n=67) Пищевые 0,901+0,158 * 0,195+0,064 0,158+0,074
4-я (n=33) Пенициллин 0,702+-0,154 * 0,238+-0,082 0,208+-0,047
Контрольная
группа (n=25)
fMLP** 0,911+-0,194 * 0,182+-0,059 0,212+-0,062

Примечание: * - достоверное отличие с р< 0,001, между уровнем активности миелопероксидазы в надосадочной жидкости лейкоцитов после инкубации с положительным и контрольным аллергенами и физиологическим раствором в группах 1-4 и контрольной группе; **- в контрольной группе в качестве агента вызывавшего выброс миелопероксидазы использовался N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (Sigma), в качестве контрольного “аллергена” – пенициллин.

Положительным результат реакции по общепризнанным правилам оценки иммуноферментной реакции [9]: при превышении величины оптической плотности отрицательного контроля и/или спонтанного выброса более чем вдвое результат считается положительным. Количество положительных реакций по результатам клинической апробации РВМ, указано в табл.2. В контрольной группе у одного пациента была положительная реакции на пенициллин, который он принимал ранее. Установлено, что у РВМ наиболее высокое выявление аллергии при пищевой сенсибилизации 82,1%. Это связано с тем, что при пищевой аллергии большую роль играют IgE-независимые механизмы аллергии, опосредованные IgG-антителами [10], а в РВМ выявляется IgE- и IgG-зависимая сенсибилизация гранулоцитов.

Таблица 2

Количество положительных реакций выявляемых в РВМ in vitro у больных 1-4-й групп с достоверно выявленной сенсибилизацией и контрольной группы

Группы
больных
Аллергены РВМ
абс. %
1-я (n=54) Бытовые 39 72,2
2-я (n=64) Пыльцевые 45 70,3
3-я (n=67) Пищевые 55 82,1
4-я (n=33) Пенициллин 24 72,7
Контрольная
группа (n=25)
fMLP** 23 92
пенициллин 1 4

Примечание: В 1-4 группах реакция ставилась с аллергенами, к которым была выявлена достоверная сенсибилизация in vivo; в контрольной группе использовали fMLP и пенницилин.

При проведении РВМ с лейкосуспензией нужно учитывать, что есть данные о снижение образования свободных гидроксильных радикалов миелопероксидазой гранулоцитов под влиянием некоторых лекарственных препаратов [11], поэтому при постановке пробы с новым лекарством в РВМ целесообразно параллельно ставить контроль с лейкосуспензией донора.

По данным наших исследований опубликованных ранее [12], нами была определена диагностическая специфичность (ДС), чувствительность (ДЧ) и эффективность (ДЭ) реакции выброса миелопероксидазы, которые составили 84,2%, 88,2% и 87,7% соответственно, что не уступает аналогичным показателям теста ППН и РПГ.

Выводы
  1. Метод РВМ позволяет выявить антитела связанные клетками, что дает более точную диагностику в острый период заболевания и/или период контакта с аллергеном.
  2. Использование метода РВМ имеет определенные преимущества (большая простота метода; экономия трудозатрат и времени проведения реакции; возможность массовых скрининговых исследований; постановка тестов с аллергенами и лекарственными препаратами не производящимися или коммерчески недоступными в настоящее время; высокая чувствительность, специфичность и эффективность) перед такими методами клеточной диагностики, как ППН и РПГ и является более подходящим методом для клинических лабораторий в настоящее время.


Ассистент кафедры аллергологии и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков

Ассистент кафедры детских болезней Н.Д. Новикова

Академик РАЕН, д.м.н, профессор Д.К. Новиков

Контакты:

Тел.:8(916) 541-98-70
(499) 201-05-77
E-mail: fideslab@yandex.ru

О лаборатории


Полезная информация

на главную


   Яндекс.Метрика