Фидеслаб - Аллергодиагностика

Диагностика аллергии

 Аллергия    Анализы на аллергию  Анализ на аллергены  Прайс-лист   О лаборатории  На главную
------------------- -------------------
Диагностика аллергии >>> О лаборатории, контакты >>> Основные методики >>> Лекарственная непереносимость

Метод диагностики аллергии к пенициллинам в иммуноферментной тест-системе

Авторы:

Ассистент кафедры аллергологии и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков.
Под ред. академика РАЕН, д.м.н., профессора Д.К. Новикова


Показания к применению

Непереносимость антибиотиков, неясные побочные реакции в анамнезе и необходимость применения препаратов. Профилактика анафилактического шока, аллергических дерматитов, крапивниц и отеков Квинке, анемий, лейкопений, гепатитов, нефритов, гастроэнтеропатий, панкреатитов, бронхиальной астмы, аллергических ринитов, вызываемых лекарствами.

Перечень необходимого оборудования

  1. Центрифуга (500-1000 об/мин)
  2. Стерильные одноразовые шприцы до 20 мл (2-3 шт.)
  3. Стерильные пробирки 10 –20мл (20-30 шт.)
  4. Термостат
  5. Холодильник
  6. Автоматические дозаторы 20 – 200 мкл
  7. Шейкер
  8. Планшеты для иммунологических реакций: плоскодонные (10-100).
  9. Анализатор планшеточного типа АИФ-01С, любой другой фотометр с длиной волны 450 нм (необязательно).

Реактивы

  1. Физиологический раствор хлорида натрия на фосфатном буфере (ФРФ) рН 7,2 или раствор Хенкса.
  2. Фосфатный буферный раствор (ФСБ) рН 7,2.
  3. Глюкоза.
  4. Фосфат-цитратный буферный раствор с рН 5,0.
  5. Карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,4.
  6. Перикись водорода – 0,015% раствор.
  7. Хромоген: тетраметилбензидин (ТМБ) или ортофенилендиамин (ОФД).
  8. Пенициллин, ампициллин и их дериваты.
  9. Нитроцеллюлоза (80 мкг/см2).
  10. Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА).
  11. Твин-20.
  12. Антитела против IgE и IgG человека, меченые пероксидазой хрена.

Описание технологии применения метода

Тест-система представляет собой нитроцеллюлозные диски или планшеты для иммуноферментного анализа, покрытые коньюгатами пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), диски отрицательного контроля покрытые ЧСА, моноклональные антитела против IgE-антител и IgG-антител человека, связанные с пероксидазой хрена, хромоген и субстратный раствор.

А. Сорбция коньюгатов пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА на нитроцеллюлозе.

  1. Полоски нитроцеллюлозы вертикально погружают в стеклянные кюветы, содержащие коньюгаты пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА, так, чтобы они не касались стенок кювет и инкубируют при 370С в термостате 3 часа. После инкубации полоски нитроцеллюлозы вынимают из кювет и отмывают 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина-20, после чего промывают чистым ФСБ без твина. Время отмывки 3-5 мин.
  2. После процедуры отмывки, удаляющей несвязавшийся с нитроцеллюлозой конъюгат, полоски опускают в 3% раствор ЧСА и инкубируют при 370С в термостате 1 час. Затем, повторяют процедуру отмывки, которая удаляет несвязавшийся ЧСА, высушивают при комнатной температуре и пробойником нарезают диски, соответствующие диаметру дна лунки иммунологического планшета (45 мм).

Приготовление полоски нитроцеллюлозы для отрицательного контроля.

  1. Полоску нитроцеллюлозы опускают в кювету, содержащую 3% раствор ЧСА и инкубируют при 370С в термостате 3 часа. После инкубации полоски нитроцеллюлозы вынимают из кювет и отмывают 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина, после чего промывают чистым ФСБ без твина. Время отмывки 3-5 мин.
  2. После отмывки, полоску высушивают при комнатной температуре и пробойником нарезают диски, соответствующие диаметру дна лунки иммунологического планшета.

Б. Сорбция коньюгатов пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА на планшете для иммуноферментного анализа.

Растворы коньюгатов пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА, а также раствор 0,5% ЧСА для отрицательного контроля пипетируют по 200 мкл в каждый ряд микропланшета и инкубируют при комнатной температуре в течении 18-24 часов. После инкубации микропланшет отмывают 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина, после чего промывают чистым ФСБ без твина. Время отмывки 3-5 мин. После процедуры отмывки, удаляющей несвязавшийся конъюгат, во все лунки микропланшета вносят 0,1% раствор ЧСА и инкубируют при 370С в термостате 1 час. Затем, повторяют процедуру отмывки, которая удаляет несвязавшийся ЧСА и высушивают при комнатной температуре.

Техника реакции

Кровь забирают из вены в пробирку и получают сыворотку. Сыворотку разводят в 2 раза (для определения IgE-антител) и/или в 100 раз (для определения IgG-антител человека) забуференным физиологическим раствором (ФРФ) рН 7,2. Сыворотку можно хранить в течение 2-3 дней при 2-80С или при –200С более года.

А. Техника реакции при постановке проб с дисками.

  1. Диски, покрытые конъюгатом антибиотиков, и диск отрицательного контроля раскладывают в лунки микропланшета в дублях.
  2. В лунки вносят по 50 мкл разведенной сыворотки и инкубируют 45 мин при комнатной температуре в шейкере (60-120 покачиваний в мин).
  3. Из лунок микропланшета удаляют сыворотку и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин.
  4. После промывки вносят анти-IgE-антитела или анти-IgG-антитела, меченные пероксидазой хрена по 50 мкл в каждую лунку микропланшета, содержащую диск, после инкубируют 45 мин при комнатной температуре в шейкере (60-120 покачиваний в мин).
  5. Из лунок микропланшета удаляют коньюгат и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин. Затем нитроцеллюлозные диски переносят в лунки другого микропланшета под теми же номерами.
  6. Внесение проявляющего раствора. Во все лунки планшеты, содержащие диски, добавляется по 150 мкл хромоген-субстратной смеси (0,015% Н2О2 и ТМБ или ОФД, разведенными фосфат-цитратным буфером с рН 5,0). Проявляющий раствор готовиться непосредственно перед внесением.
  7. Инкубация при комнатной температуре в течении 15-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета (при использовании ТМБ).
  8. Остановка реакции внесением 50 мкл 4% серной кислоты, цвет раствора изменяется на желтый.
Б. Техника реакции при постановке проб в микропланшете.
  1. В лунки вносят по 150 мкл разведенной сыворотки и инкубируют 45 мин при 370С в термостате.
  2. Из лунок микропланшета удаляют сыворотку и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин.
  3. После промывки вносят анти-IgE-антитела или анти-IgG-антитела, меченные пероксидазой хрена по 100 мкл в каждую лунку микропланшета и инкубируют 45 мин при 370С в термостате.
  4. Из лунок микропланшета удаляют коньюгат и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин.
  5. Внесение проявляющего раствора. Во все лунки планшеты, добавляется по 150 мкл хромоген-субстратной смеси (0,015% Н2О2 и ТМБ или ОФД, разведенными фосфат-цитратным буфером с рН 5,0). Проявляющий раствор готовиться непосредственно перед внесением.
  6. Инкубация при комнатной температуре в течении 15-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета (при использовании ТМБ).
  7. Остановка реакции внесением 50 мкл 4% серной кислоты, цвет раствора изменяется на желтый.
Учет результатов

Оценку реакции проводят визуально, либо на фотометре при длине волны 450 нм.

Примечание: Отрицательный контроль – не должен быть окрашен, либо слабо окрашен. (При замере на фотометре оптическая плотность в отрицательной лунке не должна превышать 0,300 е.д. оптической плотности).

Положительной реакция считается:

А. При визуальной оценке результатов – окраска опытной пробы более желтая, чем пробы отрицательного контроля и легко различима. По окрашенной шкале - оценка от «+» до «+++». В других случаях реакция трактуется как сомнительная.

Б. При фотометрической оценке результатов: оптическая плотность опытной пробы превышает оптическую плотность пробы отрицательного контроля не менее чем вдвое и она не менее 0,600. При превышении оптической плотности опытной пробы по сравнению с пробой отрицательного контроля менее чем в 2 раза, а также в других случаях результат считается сомнительным.

Противопоказания к применению

Метод применяется в условиях in vitro, абсолютных противопоказаний нет, относительным является ранний возраст пациента до 1 года, когда трудно получить достаточное количество крови для исследования.



МЕДИКО-СОЦИАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ
целесообразности практического использования метода диагностики аллергии к пенициллинам в иммуноферментной тест-системе

По данным различных авторов лекарства в 26 - 52% случаев являются причиной острых аллергических реакций [1,2]. Наиболее часто встречаются аллергические реакции на антибиотики пенициллинового ряда и среди них на пенициллин и ампициллин. Это связано, как с широким их применением, так и особенностью их химической структуры [3,4,5].

В структуру пенициллина входит тиазолидоновое кольцо, соединенное с в-лактамным, от которого зависит его антибактериальная активность. В организме в процессе биотрансформации пенициллина образуется более 10 метаболитов, каждый из которых может быть гаптеном. Основным является пенициллоил. Кроме того, сам пенициллин и его дериваты индуцируют образование антител, являясь «малыми» детерминантами, среди продуктов расщепления пенициллина важны: пенициллоат и другие метаболиты. Причем нередко они служат причиной шоковых реакций, так как могут присутствовать в готовом виде или образуются быстрее, чем «основная детерминанта».

Ампициллин относится к группе полусинтетических пенициллинов и тоже может образовывать пенициллоил и другие метаболиты пенициллина. Так как полусинтетические пенициллины содержат такое же ядро 6-аминопенициллиновой кислоты, как и пенициллин G, естественно, что между ними имеются перекрестные реакции, однако в разной степени. Больные, реагирующие на ампициллин и амоксициллин, могут не реагировать на пенициллин.

Можно считать, что при аллергии на пенициллин наблюдаются перекрестные реакции на все пенициллины и могут быть на цефалоспорины, а также на пеницилламин [3,6]. Основной причиной тяжелых аллергических реакций на пенициллины является отсутствие методов диагностики в тех случаях когда анамнез неясен. Предлагаемый метод позволяет выявлять у больных аллергию на пенициллины, что обеспечивает профилактику у них аллергических реакций.

Литература
  1. Клиническая аллергология и иммунология. Под ред. Йегера Л.,Т-1-3.,1990.
  2. Д.К. Новиков Клиническая аллергология.- Мн.,1991г.-513с.
  3. Д.К. Новиков, Ю.В. Сергеев, П.Д. Новиков. Лекарственная аллергия. – М.: Национальная академия микологии,2001. –330с.
  4. Lawor G J., Fischer T. J., Manual of Allergy and Immunology: Diagnosis and therapy. Boston 1984.
  5. Kamada M.M., Twarog F., Leung D.Y.M. Multiple antibiotic sensitivity in a pediatric population. //Allegry Proc 1991. – 12. – 347-351.
  6. Ecolano F., Bisbe E., Castillo J. et al. Drug allergy in a population of surgical patients //Rev-Esp-Anestesiol-Reanim – 1998 Dec – 45 (10) – 425-430.


Ассистент кафедры аллергологии и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков

Ассистент кафедры детских болезней Н.Д. Новикова

Академик РАЕН, д.м.н, профессор Д.К. Новиков


ОТЧЕТ О ПРЕДВАРИТЕЛЬНОМ КЛИНИЧЕСКОМ ИСПЫТАНИИ
метода диагностики аллергии к пенициллинам в иммуноферментной тест-системе.

Нами было обследовано 34 больных, которые по данным анамнеза и специфического аллергологического обследования in vivo составили группу больных лекарственной аллергией (ЛА) к препаратам пенициллинового ряда (опытная группа) и 28 доноров не болевших аллергическими заболеваниями, но получавших ранее препараты пенициллинового ряда, которые составили контрольную группу.

Таблица 1

Количество положительных реакций в группе с достоверно выявленной сенсибилизацией к антибиотикам пенициллинового ряда и контрольной группы, %

Антитела к: Больные ЛА (n=34) Доноры (n=28)
IgE-антитела IgG-антитела IgE-антитела IgG-антитела
А Б А Б А Б А Б
Пенициллину (П) 52,9 11,8 58,8 29,3 3,6 3,6 7,2 3,6
Дериватам пенициллина (ДП) 47,1 11,8 23,5 5,9 7,2 3,6 17,9 10,7
Ампициллину (А) 47,1 5,9 29,4 5,9 7,2 3,6 7,2 3,6
П и ДП - 5,9 - 5,9 - 0 - 3,6
П и А - 11,8 - 11,8 - 0 - -
А и ДП - 5,9 - 0 - 3,6 - 3,6
П, А и ДП - 23,5 - 11,8 - 0 - 0
Всего: 76,6 70,8 14,4 25,1

Примечание: А - процент положительных реакций, когда антитела выявлялись как к одному, так и к нескольким аллергенам; Б - процент положительных реакций, когда антитела выявлялись только к одному аллергену или их комбинации.

Из результатов приведенных в табл.1, видно, что IgE-положительными к пенициллину, ампициллину или дериватам пенициллина были 76,6 % пациентов, а IgG-положительные реакции наблюдались в 70,8% случаев в группе больных с достоверно выявленной аллергией к препаратам пенициллинового ряда. Необходимо отметить, что у 8 IgE-негативных пациентов 6 больных имели IgG-антитела к пенициллину, ампициллину или дериватам пенициллина, а из 10 IgG-негативных пациентов 8 были IgE-позитивными. В контрольной группе доноров, не имевших аллергии к препаратам пенициллинового ряда, но получавших их ранее, IgE-позитивными были 14,4%, а IgG-позитивными – 25,1% к пенициллину, ампициллину или дериватам пенициллина. У 3 из 4 IgE-позитивных доноров были выявлены и IgG-антитела.

По спектру положительных результатов к вышеперечисленным аллергенам в опытной группе больных, чаще встречались IgE-антитела к пенициллину (52,9%) и IgG-антитела к пенициллину (58,8%), при этом ко всем трем аллергенам IgE-положительными были 23,5%, а IgG-положительными были 11,8% пациентов. К пенициллину и ампициллину антитела обоих классов обнаруживались с одинаковой частотой – в 11,8% случаев. Только к пенициллину IgE-антитела выявлялись у 11,8%, а IgG-антитела у 29,3% больных. В контрольной группе среди позитивных ответов чаще встречались антитела к дериватам пенициллина: IgG-антитела в 17,9%, IgE-антитела в 7,2% случаев.

Таблица 2

Диагностическая специфичность, чувствительность и эффективность метода определения антител к пенициллина при разных вариантах ее постановки

Определение антител к пенициллину, ампициллину и дериватам пенициллина класса: ДС,% ДЭ,% ДЧ,%
только IgE 87,5 83,9 76,4
только IgG 80 78,3 70,6
IgE и IgG 77,8 86,1 94,1

По данным наших исследований была определена диагностическая специфичность (ДС), чувствительность (ДЧ) и эффективность (ДЭ) предлагаемого метода диагностики аллергии к пенициллинам, по определению антител к трем аллергенам пенициллинового ряда (пенициллин, ампициллин, дериваты пенициллина) для трех вариантов постановки метода: определение только IgE-антител, только IgG-антител и IgE-,IgG-антител. (табл. 2). По данным табл.2, видно, что при определении антител к пенициллинам обоих классов достигается высокая ДЧ и ДЭ - 94,1% и 86,1%, соответственно. Более низкое значение ДС при таком варианте определения антител к пенициллинам, объясняется наличием аллергенспецифических антител у некоторой части доноров, которые, хотя и не было непереносимости препаратов пенициллинового ряда, но имели контакт с ними в анамнезе, что и привело к сенсибилизации организма к этим аллергенам.

Следовательно, определение IgE и IgG антител к 3-м видам аллергенов наиболее достоверно позволяет диагностировать аллергию к пенициллинам.

Выводы
  1. Метод определения аллергии к пенициллинам с тремя аллергенами и определением антител IgE и IgG классов позволяет достигнуть высокой диагностической эффективности и чувствительности; обеспечивает раннее выявление сенсибилизации у лиц, получавших пенициллин, но не имевших на него клинических реакций.
  2. Метод может использоваться, как в отдельных случаях диагностики, так и для массовых скрининговых исследований; он не сложен в постановке и может применяться в клинических лабораториях стационаров и поликлиник.


Ассистент кафедры аллергологии и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков

Ассистент кафедры детских болезней Н.Д. Новикова

Академик РАЕН, д.м.н, профессор Д.К. Новиков


Контакты:

Тел.:8(916) 541-98-70
(499) 201-05-77
E-mail: fideslab@yandex.ru

Статьи об аллергии


О лаборатории

на главную


   Яндекс.Метрика