-------------------
-------------------
|
Метод диагностики аллергии к пенициллинам в иммуноферментной тест-системе
Авторы:
Ассистент кафедры аллергологии и клинической иммунологии, к.м.н.
П.Д. Новиков.
Под ред. академика РАЕН, д.м.н., профессора Д.К. Новикова
Показания к применению
Непереносимость антибиотиков, неясные побочные реакции в анамнезе и необходимость применения препаратов. Профилактика анафилактического шока, аллергических дерматитов, крапивниц и отеков Квинке, анемий, лейкопений, гепатитов, нефритов, гастроэнтеропатий, панкреатитов, бронхиальной астмы, аллергических ринитов, вызываемых лекарствами.
Перечень необходимого оборудования
- Центрифуга (500-1000 об/мин)
- Стерильные одноразовые шприцы до 20 мл (2-3 шт.)
- Стерильные пробирки 10 –20мл (20-30 шт.)
- Термостат
- Холодильник
- Автоматические дозаторы 20 – 200 мкл
- Шейкер
- Планшеты для иммунологических реакций: плоскодонные (10-100).
- Анализатор планшеточного типа АИФ-01С, любой другой фотометр с длиной волны 450 нм (необязательно).
Реактивы
- Физиологический раствор хлорида натрия на фосфатном буфере (ФРФ) рН 7,2 или раствор Хенкса.
- Фосфатный буферный раствор (ФСБ) рН 7,2.
- Глюкоза.
- Фосфат-цитратный буферный раствор с рН 5,0.
- Карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,4.
- Перикись водорода – 0,015% раствор.
- Хромоген: тетраметилбензидин (ТМБ) или ортофенилендиамин (ОФД).
- Пенициллин, ампициллин и их дериваты.
- Нитроцеллюлоза (80 мкг/см2).
- Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА).
- Твин-20.
- Антитела против IgE и IgG человека, меченые пероксидазой хрена.
Описание технологии применения метода
Тест-система представляет собой нитроцеллюлозные диски или планшеты для иммуноферментного анализа, покрытые коньюгатами пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), диски отрицательного контроля покрытые ЧСА, моноклональные антитела против IgE-антител и IgG-антител человека, связанные с пероксидазой хрена, хромоген и субстратный раствор.
А. Сорбция коньюгатов пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА на нитроцеллюлозе.
- Полоски нитроцеллюлозы вертикально погружают в стеклянные кюветы, содержащие коньюгаты пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА, так, чтобы они не касались стенок кювет и инкубируют при 370С в термостате 3 часа. После инкубации полоски нитроцеллюлозы вынимают из кювет и отмывают 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина-20, после чего промывают чистым ФСБ без твина. Время отмывки 3-5 мин.
- После процедуры отмывки, удаляющей несвязавшийся с нитроцеллюлозой конъюгат, полоски опускают в 3% раствор ЧСА и инкубируют при 370С в термостате 1 час. Затем, повторяют процедуру отмывки, которая удаляет несвязавшийся ЧСА, высушивают при комнатной температуре и пробойником нарезают диски, соответствующие диаметру дна лунки иммунологического планшета (45 мм).
Приготовление полоски нитроцеллюлозы для отрицательного контроля.
- Полоску нитроцеллюлозы опускают в кювету, содержащую 3% раствор ЧСА и инкубируют при 370С в термостате 3 часа. После инкубации полоски нитроцеллюлозы вынимают из кювет и отмывают 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина, после чего промывают чистым ФСБ без твина. Время отмывки 3-5 мин.
- После отмывки, полоску высушивают при комнатной температуре и пробойником нарезают диски, соответствующие диаметру дна лунки иммунологического планшета.
Б. Сорбция коньюгатов пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА на планшете для иммуноферментного анализа.
Растворы коньюгатов пенициллина, дериватов пенициллина и ампициллина с ЧСА, а также раствор 0,5% ЧСА для отрицательного контроля пипетируют по 200 мкл в каждый ряд микропланшета и инкубируют при комнатной температуре в течении 18-24 часов. После инкубации микропланшет отмывают 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина, после чего промывают чистым ФСБ без твина. Время отмывки 3-5 мин. После процедуры отмывки, удаляющей несвязавшийся конъюгат, во все лунки микропланшета вносят 0,1% раствор ЧСА и инкубируют при 370С в термостате 1 час. Затем, повторяют процедуру отмывки, которая удаляет несвязавшийся ЧСА и высушивают при комнатной температуре.
Техника реакции
Кровь забирают из вены в пробирку и получают сыворотку. Сыворотку разводят в 2 раза (для определения IgE-антител) и/или в 100 раз (для определения IgG-антител человека) забуференным физиологическим раствором (ФРФ) рН 7,2. Сыворотку можно хранить в течение 2-3 дней при 2-80С или при –200С более года.
А. Техника реакции при постановке проб с дисками.
- Диски, покрытые конъюгатом антибиотиков, и диск отрицательного контроля раскладывают в лунки микропланшета в дублях.
- В лунки вносят по 50 мкл разведенной сыворотки и инкубируют 45 мин при комнатной температуре в шейкере (60-120 покачиваний в мин).
- Из лунок микропланшета удаляют сыворотку и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин.
- После промывки вносят анти-IgE-антитела или анти-IgG-антитела, меченные пероксидазой хрена по 50 мкл в каждую лунку микропланшета, содержащую диск, после инкубируют 45 мин при комнатной температуре в шейкере (60-120 покачиваний в мин).
- Из лунок микропланшета удаляют коньюгат и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин. Затем нитроцеллюлозные диски переносят в лунки другого микропланшета под теми же номерами.
- Внесение проявляющего раствора. Во все лунки планшеты, содержащие диски, добавляется по 150 мкл хромоген-субстратной смеси (0,015% Н2О2 и ТМБ или ОФД, разведенными фосфат-цитратным буфером с рН 5,0). Проявляющий раствор готовиться непосредственно перед внесением.
- Инкубация при комнатной температуре в течении 15-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета (при использовании ТМБ).
- Остановка реакции внесением 50 мкл 4% серной кислоты, цвет раствора изменяется на желтый.
Б. Техника реакции при постановке проб в микропланшете.
- В лунки вносят по 150 мкл разведенной сыворотки и инкубируют 45 мин при 370С в термостате.
- Из лунок микропланшета удаляют сыворотку и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин.
- После промывки вносят анти-IgE-антитела или анти-IgG-антитела, меченные пероксидазой хрена по 100 мкл в каждую лунку микропланшета и инкубируют 45 мин при 370С в термостате.
- Из лунок микропланшета удаляют коньюгат и отмывают не менее 3 раза ФСБ раствором с рН 7,2 с 0,05% содержанием твина. Время экспозиции промывающего раствора 4-5 мин.
- Внесение проявляющего раствора. Во все лунки планшеты, добавляется по 150 мкл хромоген-субстратной смеси (0,015% Н2О2 и ТМБ или ОФД, разведенными фосфат-цитратным буфером с рН 5,0). Проявляющий раствор готовиться непосредственно перед внесением.
- Инкубация при комнатной температуре в течении 15-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета (при использовании ТМБ).
- Остановка реакции внесением 50 мкл 4% серной кислоты, цвет раствора изменяется на желтый.
Учет результатов
Оценку реакции проводят визуально, либо на фотометре при длине волны 450 нм.
Примечание: Отрицательный контроль – не должен быть окрашен, либо слабо окрашен. (При замере на фотометре оптическая плотность в отрицательной лунке не должна превышать 0,300 е.д. оптической плотности).
Положительной реакция считается:
А. При визуальной оценке результатов – окраска опытной пробы более желтая, чем пробы отрицательного контроля и легко различима. По окрашенной шкале - оценка от «+» до «+++». В других случаях реакция трактуется как сомнительная.
Б. При фотометрической оценке результатов: оптическая плотность опытной пробы превышает оптическую плотность пробы отрицательного контроля не менее чем вдвое и она не менее 0,600. При превышении оптической плотности опытной пробы по сравнению с пробой отрицательного контроля менее чем в 2 раза, а также в других случаях результат считается сомнительным.
Противопоказания к применению
Метод применяется в условиях in vitro, абсолютных противопоказаний нет, относительным является ранний возраст пациента до 1 года, когда трудно получить достаточное количество крови для исследования.
МЕДИКО-СОЦИАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ
целесообразности практического использования метода диагностики аллергии к пенициллинам в иммуноферментной тест-системе
По данным различных авторов лекарства в 26 - 52% случаев являются причиной острых аллергических реакций [1,2]. Наиболее часто встречаются аллергические реакции на антибиотики пенициллинового ряда и среди них на пенициллин и ампициллин. Это связано, как с широким их применением, так и особенностью их химической структуры [3,4,5].
В структуру пенициллина входит тиазолидоновое кольцо, соединенное с в-лактамным, от которого зависит его антибактериальная активность. В организме в процессе биотрансформации пенициллина образуется более 10 метаболитов, каждый из которых может быть гаптеном. Основным является пенициллоил. Кроме того, сам пенициллин и его дериваты индуцируют образование антител, являясь «малыми» детерминантами, среди продуктов расщепления пенициллина важны: пенициллоат и другие метаболиты. Причем нередко они служат причиной шоковых реакций, так как могут присутствовать в готовом виде или образуются быстрее, чем «основная детерминанта».
Ампициллин относится к группе полусинтетических пенициллинов и тоже может образовывать пенициллоил и другие метаболиты пенициллина. Так как полусинтетические пенициллины содержат такое же ядро 6-аминопенициллиновой кислоты, как и пенициллин G, естественно, что между ними имеются перекрестные реакции, однако в разной степени. Больные, реагирующие на ампициллин и амоксициллин, могут не реагировать на пенициллин.
Можно считать, что при аллергии на пенициллин наблюдаются перекрестные реакции на все пенициллины и могут быть на цефалоспорины, а также на пеницилламин [3,6]. Основной причиной тяжелых аллергических реакций на пенициллины является отсутствие методов диагностики в тех случаях когда анамнез неясен. Предлагаемый метод позволяет выявлять у больных аллергию на пенициллины, что обеспечивает профилактику у них аллергических реакций.
Литература
- Клиническая аллергология и иммунология. Под ред. Йегера Л.,Т-1-3.,1990.
- Д.К. Новиков Клиническая аллергология.- Мн.,1991г.-513с.
- Д.К. Новиков, Ю.В. Сергеев, П.Д. Новиков. Лекарственная аллергия. – М.: Национальная академия микологии,2001. –330с.
- Lawor G J., Fischer T. J., Manual of Allergy and Immunology: Diagnosis and therapy. Boston 1984.
- Kamada M.M., Twarog F., Leung D.Y.M. Multiple antibiotic sensitivity in a pediatric population. //Allegry Proc 1991. – 12. – 347-351.
- Ecolano F., Bisbe E., Castillo J. et al. Drug allergy in a population of surgical patients //Rev-Esp-Anestesiol-Reanim – 1998 Dec – 45 (10) – 425-430.
Ассистент кафедры аллергологии
и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков
Ассистент кафедры детских болезней Н.Д. Новикова
Академик РАЕН, д.м.н, профессор Д.К. Новиков
ОТЧЕТ О ПРЕДВАРИТЕЛЬНОМ КЛИНИЧЕСКОМ ИСПЫТАНИИ
метода диагностики аллергии к пенициллинам в иммуноферментной тест-системе.
Нами было обследовано 34 больных, которые по данным анамнеза и специфического аллергологического обследования in vivo составили группу больных лекарственной аллергией (ЛА) к препаратам пенициллинового ряда (опытная группа) и 28 доноров не болевших аллергическими заболеваниями, но получавших ранее препараты пенициллинового ряда, которые составили контрольную группу.
Таблица 1
Количество положительных реакций в группе с достоверно выявленной сенсибилизацией к антибиотикам пенициллинового ряда и контрольной группы, %
Антитела к: |
Больные ЛА (n=34) |
Доноры (n=28) |
IgE-антитела |
IgG-антитела |
IgE-антитела |
IgG-антитела |
А |
Б |
А |
Б |
А |
Б |
А |
Б |
Пенициллину (П) |
52,9 |
11,8 |
58,8 |
29,3 |
3,6 |
3,6 |
7,2 |
3,6 |
Дериватам
пенициллина (ДП) |
47,1 |
11,8 |
23,5 |
5,9 |
7,2 |
3,6 |
17,9 |
10,7 |
Ампициллину (А) |
47,1 |
5,9 |
29,4 |
5,9 |
7,2 |
3,6 |
7,2 |
3,6 |
П и ДП |
- |
5,9 |
- |
5,9 |
- |
0 |
- |
3,6 |
П и А |
- |
11,8 |
- |
11,8 |
- |
0 |
- |
- |
А и ДП |
- |
5,9 |
- |
0 |
- |
3,6 |
- |
3,6 |
П, А и ДП |
- |
23,5 |
- |
11,8 |
- |
0 |
- |
0 |
Всего: |
76,6 |
70,8 |
14,4 |
25,1 |
Примечание: А - процент положительных реакций, когда антитела выявлялись как к одному, так и к нескольким аллергенам; Б - процент положительных реакций, когда антитела выявлялись только к одному аллергену или их комбинации.
Из результатов приведенных в табл.1, видно, что IgE-положительными к пенициллину, ампициллину или дериватам пенициллина были 76,6 % пациентов, а IgG-положительные реакции наблюдались в 70,8% случаев в группе больных с достоверно выявленной аллергией к препаратам пенициллинового ряда. Необходимо отметить, что у 8 IgE-негативных пациентов 6 больных имели IgG-антитела к пенициллину, ампициллину или дериватам пенициллина, а из 10 IgG-негативных пациентов 8 были IgE-позитивными. В контрольной группе доноров, не имевших аллергии к препаратам пенициллинового ряда, но получавших их ранее, IgE-позитивными были 14,4%, а IgG-позитивными – 25,1% к пенициллину, ампициллину или дериватам пенициллина. У 3 из 4 IgE-позитивных доноров были выявлены и IgG-антитела.
По спектру положительных результатов к вышеперечисленным аллергенам в опытной группе больных, чаще встречались IgE-антитела к пенициллину (52,9%) и IgG-антитела к пенициллину (58,8%), при этом ко всем трем аллергенам IgE-положительными были 23,5%, а IgG-положительными были 11,8% пациентов. К пенициллину и ампициллину антитела обоих классов обнаруживались с одинаковой частотой – в 11,8% случаев. Только к пенициллину IgE-антитела выявлялись у 11,8%, а IgG-антитела у 29,3% больных. В контрольной группе среди позитивных ответов чаще встречались антитела к дериватам пенициллина: IgG-антитела в 17,9%, IgE-антитела в 7,2% случаев.
Таблица 2
Диагностическая специфичность, чувствительность и эффективность метода определения антител к пенициллина при разных вариантах ее постановки
Определение антител к пенициллину, ампициллину и дериватам пенициллина класса: |
ДС,% |
ДЭ,% |
ДЧ,% |
только IgE |
87,5 |
83,9 |
76,4 |
только IgG |
80 |
78,3 |
70,6 |
IgE и IgG |
77,8 |
86,1 |
94,1 |
По данным наших исследований была определена диагностическая специфичность (ДС), чувствительность (ДЧ) и эффективность (ДЭ) предлагаемого метода диагностики аллергии к пенициллинам, по определению антител к трем аллергенам пенициллинового ряда (пенициллин, ампициллин, дериваты пенициллина) для трех вариантов постановки метода: определение только IgE-антител, только IgG-антител и IgE-,IgG-антител. (табл. 2). По данным табл.2, видно, что при определении антител к пенициллинам обоих классов достигается высокая ДЧ и ДЭ - 94,1% и 86,1%, соответственно. Более низкое значение ДС при таком варианте определения антител к пенициллинам, объясняется наличием аллергенспецифических антител у некоторой части доноров, которые, хотя и не было непереносимости препаратов пенициллинового ряда, но имели контакт с ними в анамнезе, что и привело к сенсибилизации организма к этим аллергенам.
Следовательно, определение IgE и IgG антител к 3-м видам аллергенов наиболее достоверно позволяет диагностировать аллергию к пенициллинам.
Выводы
- Метод определения аллергии к пенициллинам с тремя аллергенами и определением антител IgE и IgG классов позволяет достигнуть высокой диагностической эффективности и чувствительности; обеспечивает раннее выявление сенсибилизации у лиц, получавших пенициллин, но не имевших на него клинических реакций.
- Метод может использоваться, как в отдельных случаях диагностики, так и для массовых скрининговых исследований; он не сложен в постановке и может применяться в клинических лабораториях стационаров и поликлиник.
Ассистент кафедры аллергологии
и клинической иммунологии, к.м.н. П.Д. Новиков
Ассистент кафедры детских болезней Н.Д. Новикова
Академик РАЕН, д.м.н, профессор Д.К. Новиков
|
Контакты:
Статьи об аллергии
О лаборатории
на главную
|
|